Сабақтың мақсатты: Зертханалық ыдыстарды және мақталы тығындарды әзірлеу. Ет суын және ет-пептонды сорпасын (ЕПС), ет-петонды агарын (ЕПА) дайындау. Қоректік орталардың рН-ын колориметриялық және басқа да тәсілдермен анықтау. Стерильдеу тәсілдерімен танысып, дайындалған қоректік орталарды бу стерилизаторында стерильдеу және олардың стерильділігін термостатқа қою арқылы бақылау. Бу стерилизаторының, Кох аппаратының, кептіргіш шкафтың, Зейтц сүзгішінің және т.б. құрылысы мен істеу тәртібімен танысу.
Жабдықтар мен материалдар. Еттің суын дайындауға арналған ыдыс, 1000С-қа дейінгі бөліктері бар термометр. Аралыстыруға арналған шыны таяқшалар. Ет тартқыш, ет, пышақ, дәке, мақта, воронка. Эрленмейердің сыймдылығы 1 литрлік екі колбасы, 500 мл-ге дейінгі бөліктері бар мензуркалар мен цилиндрлер. Электр және газ плиталары. ЕПС мен ЕПА дайындау үшін: әр студент үшін сыймдылығы 250 мл Эрленмейер колбасы, 100-200 мл-лік мензуркалар. Тығындарды дайындауға арналған мақталар. Сүзгіш қағаздар. Воронкалар. Қоректік орталарды дайындау рецептері. Екі үш таразы. Пептон, натрий хлориды (ас тұзы), агар-агар, фарфордан немесе пластиктен жасалған қасықшалар. рН метр, 10% натрий гидроокисінің ерітіндісі. Шаюға және рН анықтауға арналған дистильденген су (екі стаканда 200 мл-ден), 0,1; 1; 10 мл-лік пипеткалар. Бу стерилизаторы, Кох аппараты, кептіргіш шкаф (Пастер пеші), Зейтц сүзгіші, су стерилизаторлары және басқа жабдықтар. Студенттер ет суын, ЕПС, ЕПА дайындаған соң шыны түтіктерге құйып (3-4 мл), стерильдейді.
Микроорганизмдердің қоректенуі. Жасуша ішіне сыртқы ортадан енген қоректік заттардан жаңа заттардың түзілуі немесе олардың ыдырауы күрделі биохимиялық процестердің көмегімен іске асып отырады. Микроорганизмдер табиғатта қоректік заттарды өсімдіктер мен жануарлар қалдықтарынан немесе тірі жасушалардан алады.
Зертханаларда микроорганизмдерді өсіру үшін арнайы әзірленген қоректік орталар қолданылады. Оларды өздерінің құрамына қарай табиғи (сүт, сарысу, жұмыртқа, ет, картоп, бұршақ, сәбіз, т.б.) және жасанды қоректік орталар деп екіге бөлінеді. Жасанды қоректік орталар арнайы рецептер бойынша дайындалады. Олар жануар текті (ЕПС, ЕПА, ЕПЖ) және өсімдік текті (сыра суслосы) болып екі топқа бөлінеді. Барлық микроорганизмдер бір ғана қоректік ортада өсе бермейді. Әр организм өзінің өсіп дамуына арнайы құрамы бар қоректік ортаны керек етеді. Берілген бір ғана микроорганизмнің түрін өсіруге арналған қоректік орталарды элективті (таңдаулы) орталар деп атайды. Дайындалған орталарды құрғақ, салқын орындарда ұстайды, қоректік орталарға арналған ыдыстарды (шыны түтіктерді) жақсылап жуып, нейтралдап, кептірген соң бу стерилизаторында немесе кептіргіш шкафта стерильдейді (160-1700С). Мақталы тығындарды қолмен немесе тығын жасағыш қондырғы көмегімен әзірлейді. Қолданылған тығындарды әуелі кептіреді, сонан соң стерильдейді. Мақталы тығындар құрғақ және шыны түтікке жақсы үйлестірілген болуы керек. Дымқыл жерде олар ылғалды тартып алып, зең саңырауқұлақтардың өсуіне жағдай туғызады. Бұл саңырауқұлақтар және басқа микроорганизмдер шыны түтіктің ішіне түседі де, қоректік ортаның стерильділігін бұзады.
Жасанды қоректік орталар және олардың компоненттері. Еттің суы көптеген көректік орталардың негізгі компоненті болып саналады. Ол жылқы немесе қара малдың сапалы еттерінен дайындалады. Сүйек, сіңір, фасция және майлары аланып тасталады. Кәрі малдың етін қоректік ортаны дайындауға қолданбау керек. Етті еттартқыштан өткізіп, өлшейді, сонан соң оған ағын суының екі есе мөлшерін құяды да, 18-24 сағатқа салқын жерде қалдырады. Фаршты сығып алып, еттің экстрактын 30-40 минут әлсіз отта қайнатады. Мақталы дәке сүзгіштен экстракты өткізгеннен соң, қайта қағаз сүзгішпен сүзеді де бастапқы мөлшеріне ағын суын құю арқылы келтіреді. Ет суын шыны сауыттарға құйып 1200С-та 30 минут стерильдейді.
Ет суын дайындау процесін жеделдету үшін фаршқа екі есе мөлшерде ағын суын қосады да, бір сағат бойы 500С-та қыздырады. Пайда болған массаны екі қабатталған дәкемен сүзіп, етті сығып, алынған сұйықтықты 30 минут қайнатады. Ұйып қалған белоктарды мақталы-дәкеден, сонан соң сүзгіш қағаздан өткізу арқылы бөліп алады. Фильтратқа оның бастапқы мөлшеріне дейін ағын суын қосып, шыны сауыттарға, шыны түтіктерге құйып, 1200С-та 30 минут стерильдейді. Дайын ет суының рН мөлшері 6,8-6,5 шамасында болады.
Ет-пептонды сорпа (ЕПС). Ет суына 1 % пептон мен 0,5 % натрий хлоридын қосады. Ет суын пептонның толық ерігеніне дейін араластыра отыра қайнатып, оның рН мөлшерін потенциометрдің көмегімен анықтайды. Қоректік ортаның рН-ын 10% натрий сілтісінің ерітіндісі немесе натрий гидрокарбонатының (ас содасының) қаныққан ертіндісімен 7,4-7,6-ға жеткізеді. Сілтіні сорпаға қосқаннан кейін, оны тағы да 5-10 минут қайнатады. Сонан соң сорпаны дистильденген сумен дымқылданған сүзгіш қағаздан өткізеді. Ет-пептонды сорпаны шыны түтіктерге құйып 1200С температурада 20 минут бойы стерильдейді.
Ет-пептонды агарды (ЕПА) дайындау үшін ЕПС-ға 2-3% агар-агарды қоса отыра балқытады. Балқыту кезінде қоректік ортаны агар-агардың күйіп кетпеуі үшін әлсін-әлсін араластырып отырады. Балқытылған ЕПА-ын ыстық күйінде тез сүзіп (мақталы-дәке арқылы) шыны түтіктерге құяды. «Қиғаш» қатырылған ЕПА-ды 3-4 мл-ден, ал «тік» қатырылған ЕПА-ды шыны түтіктерге 10 мл-ден құяды. Шыны түтіктер тығындармен жабылып 1200С-та 20-30 минут стерильденеді.
Ет-пептонды желатин (ЕПЖ) микроорганизмдердің белокты ыдырату қасиетін анықтау үшін қолданылады. ЕПЖ-ды 10-15% желатин қосу арқылы дайындайды. Әуелі желатинді 15 минут ЕПС-нда ісіндіріп алған соң су моншасында 500С температурада балқытады. Ортаның рН-ын 7,3-ке дейін апарып, 20 минут 1200С температурада стерильдейді.
Сусло-агар (СА) зең саңырауқұлақтарды, ашытқыларды және басқа микроорганизмдерді өсіруде колданылады. Сусло (сыра ашытқысы) құрамында көмірсулар, амин қышқылдары, В тобы витаминдері минералды тұздар және басқа пластикалық материалдар мен энергияның көзі болып табылатын заттардың көптеген мөлшері (20% дейін) болады. Сусло-агарды қызбаған суслоға 2-3% агар-агарды қосу арқылы әзірлейді. Қызбаған суслоны сыра қайнататын заводтан алуға немесе зертханада дайындауға болады. Жаңа дайындалған сыра ашытқысында қанттың концентрациясы 14-180-ке дейін жетеді. Баллинг градустары (0Б) ареометрдің көмегімен анықталады. Қанттың керекті концентрациясын келтіру үшін ортаға ағын су қосады.
Зең саңырауқұлақтарды – 4-60Б, ашытқыларды – 6-80Б, сүт қышқылды микробтарды – 8-120Б мөлшерінде қанттары бар ортада өсіреді.
Агар және желатин қосылған орталарды мақтасы бар дәкемен сүзу арқылы немесе тауық жұмыртқасының белогы көмегімен мөлдір етуге болады. Сарысынан ажыратылған жұмыртқаның белогын сол мөлшердегі сумен араластырып, көбіктің пайда болуына дейін араластырады. Көпіршіктелген белокты балқытып 500С-қа дейін суытылған ортаға қосып, жақсылап араластырғаннан кейін қайнап жатқан су моншасында бір сағат бойы қыздырады. Белок ұйып, қоректік ортадағы қалқып жүрген бөлшектері өзіне тартып алады. Орта сүзілгеннен кейін мөлдірленеді.
Қоректік ортаның жоғарғы бөлігінің мөлдіреуі сонымен қатар баяу салқындату кезінде де байқалады. Бұл үшін қоректік ортаны стерильдегеннен соң оны бу стерилизаторының ішінде 10-12 сағатқа қалдырады. Қоректік орта тығыздалғанға дейін қалқып жүрген бөлшектер шыны түтіктердің немесе шыны ыдыстардың түбіне шөгеді.
Китта–Троцци ортасы (ЕПБС) анаэробты микроорганизмдерді өсіруге арналған. Оның құрамында қоректік сорпа, 0,5% натрий хлориды, оттегін сорып алуға қажетті бауыр немесе бұлшық ет түйіршіктері болады. Ортаның рН-ын 7,6-7,8-ге жеткізеді. Ортаның бетіне жұқалап индифферентті вазелин майын құйып 30 минут қайнатады. Микробтарды қоректік ортаға себер алдында, қоректік ортадағы ауаны кетіру үшін, ортаны қайнап жатқан су моншасында 15 минут ұстайды. Дайындалған қоректік орталардың стерильділігін тексеру үшін оларды 3 тәулікке 370С-қа реттелген термостатқа қояды. Ешқандай микроорганизмдердің өсуінің байқалмауы ортаның жақсы стерильденгенінің дәлелі, ал өсуі бар орталар байқалса барлық партия жарамсыз деп табылады.
Қоректік орта компоненттерінің қысқаша сипаттамасы.
Агар-агар кейбір теңіз балдырларын сумен қосып қайнату кезінде пайда болатын экстракт. Судағы пайда болған масса сілікпе тәрізді болады. Жоғарғы сапалы агар-агар ТМД, Жапония және басқа да елдерде қызыл түсті теңіз балдырларынан дайындалады. Құрамына қарай агар-агар өте күрделі органикалық қоспа (70-80% полисахарид) болып табылады. Агар-агар әлсіз сары түсті ұнтақ, пластина және жіп тәрізді болады.
Пептон-қышқыл ортада ферменттердің әсерінен толық ыдырамаған белоктардың өнімі. Оның құрамы микробтардың тіршілігіне қажетті полипептидтер мен амин қышқылдарының қоспасынан тұрады. Пептонды ірі және ұсақ қара малдың үлкен қарнынан алады. Ол суда жақсы ериді, қыздырғанда ұйымайды, тұз ерітінділерін қосқанда тұнбаға түседі.
Желатин-белоктан тұратын жануарлар желімі. Оны шеміршектерді, сүйектерді, сіңірлерді әбден қайнату арқылы алады. Олардың сырт көрінісі ашық қоңыр түсті жапырақшалар тәрізді болып келеді. Иісі, дәмі болмайды, 32-340С температурада балқи бастайды, 160С-та қатады.
